Otimização da transformação genética de Eucalyptus por bombardeamento de partículas

Resumo

A utilização de micropartículas de tungstênio cobertas com DNA e submetidas a uma rápida descarga de alta pressão de gás hélio é o principal meio de introdução de genes em tecidos vegetais que independe da ação viral ou bacteriana e, portanto, não limita- se ou depende da relação patógeno-hospedeiro, espécies e genótipos. A transformação genética de explantes de Eucalyptusmediada por agrobactérias é bastante ineficiente para a maioria das espécies e clones deste gênero arbóreo e, por isso, o estabelecimento de um protocolo eficiente por meio do acelerador de partículas “Particle Inflow Gun” para modificar geneticamente eucalipto é uma alternativa, embora também desafiador. Fatores como a substância utilizada para a lavagem e a ressuspensão de micropartículas, a concentração de micropartículas e de DNA plasmidial, assim como a distância percorrida pelas partículas, o tipo de tecido vegetal exposto o bombardeamento, o número de disparos realizados no tecido vegetal e a utilização de um anteparo para dispersar as partículas foram considerados como limitantes para estabelecer um protocolo ideal. Assim, foram testados dois tratamentos com duas distâncias (A1~12 cm; A2~10 cm) e número de disparos (D1: um disparo; D2: dois disparos) distintos nos tecidos utilizados (segmentos nodais de eucalipto e calos de orquídea). Concentrações de tungstênio (50 mg em 500 μL de água estéril) e de DNA plasmidial contendo o gene GUS como repórter (em média 250 ng/μL por bombardeamento) foram utilizadas nos experimentos. Paralelamente, análise histológica dos tecidos bombardeados foi realizada. O bombardeamento de calos de orquídea como tecido controle com os tratamentos A2D1 e A2D2 resultou em células com expressão do gene repórter e esses tratamentos foram então aplicados em eucalipto. A análise histológica dos explantes de eucalipto demonstrou baixa frequência de partículas no tecido, com penetração apenas nas células mais superficiais dos explantes. Além disso, as partículas encontravam-se em grandes glomerados, o que pode ter interferido na eficiência da expressão do gene introduzido. A ausência de expressão do gene GUS e o estudo histológico em tecidos de eucalipto levaram a modificações na metodologia como a retirada do anteparo, o aumento da concentração de DNA plasmidial, o aumento da pressão de disparo e a utilização de calos como explantes-alvo para a introdução do DNA. Esses testes estão em andamento para que seja estabelecido um protocolo mais eficiente de transformação.